全面解读│10篇文章揭示食管鳞癌研究进展③
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全面解读│10篇文章揭示食管鳞癌研究进展②
ESCC基因突变和预后
发表期刊：Nature Genetics
发表时间：2014年8月
影响因子：31.62
研究方法：外显子组测序
研究背景：我国食管癌患者主要为ESCC，其发病因素等方面与国外的食管癌有明显的不同。该研究意在对中国北方ESCC病人的突变情况进行研究，检测显著突变基因以及潜在的预后标志物。
研究样本：113对原发性ESCC 肿瘤-对照样本；8个细胞系（7个为KYSE细胞系，1个为Het-1A细胞系）
研究内容：
（1） 体细胞突变情况
通过对ESCC 肿瘤-对照样本进行外显子组测序，共检测到9197个非沉默突变，且其最常见的突变类型是C>T的转换。一共有70个基因在至少5%的病人中突变，验证了已经报导过的TP53、CDKN2A、NFE2L2等基因突变。另外，发现NOTCH1、NOTCH2或NOTCH3基因突变在中国人群和美国人群中有相似的比例。用MutSigCV算法得到6个SMG: TP53、CDKN2A、AJUBA、 RB1、NOTCH1、NFE2L2。已知的癌症基因突变聚集在以下几个重要的通路中：细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤控制通路。细胞系外显子组测序也发现了相似的基因改变。
图1 全基因组范围的突变图谱
（2）组蛋白修饰基因
发现63%的ESCC病人组蛋白修饰基因有非沉默突变。11个病人在EP300基因上有错义突变，7个病人在EP300同源的基因——CREBBP基因中有突变。对突变的p300蛋白表达量进行分析，推断出p300蛋白在ESCC中可能具有肿瘤抑制功能。对总生存率进行分析，发现EP300基因突变与较差的预后有关。
（3）其他组蛋白修饰基因
发现在35个病人中，组蛋白甲基转移酶复合物的核心成员有突变。KMT2D突变的比例显著高于以往报导过的中国ESCC病人的比例。KMT2C、NSD1、组蛋白H3修饰基因在超过一半的病人中出现，可以作为ESCC基因突变标志物。
图2 ESCC中的KMT2D和KMT2C蛋白发生改变
（4） Hippo pathway regulators
在AJUBA基因中发现8个突变，且AJUBA基因在突变的肿瘤中表达量较低，反映了该基因频繁截断突变的可能翻译结果。肿瘤组织中，AJUBA基因的表达水平与YAP1磷酸化负相关。这些结果表明AJUBA基因对hippo通路具有调节功能。另外，FAT1、FAT2、FAT3或FAT4在31个病人中有突变。总之，ESCC与其他鳞状细胞癌有较多共同的突变基因，与EAC有较少共同的突变基因。
图3 AJUBA基因上对hippo通路具有调节作用位点的改变
图4 体细胞变化的信号通路
研究意义：该研究提供了中国ESCC病人比较全面的突变图谱，包括比较常见的突变基因与信号通路，为ESCC的预后与靶向治疗提供了理论基础。
7、ESCC的基因组表征揭示了肿瘤发生和
不良预后的关键基因[2]
发表期刊：The American Journal of Human Genetics
发表时间：2016年4月
影响因子：10.79
研究方法：全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)
研究背景：ESCC不良预后的遗传机制尚不清楚
研究样本：10对肿瘤-对照样本的WGS数据；57对肿瘤-对照样本的WES数据；321个样本的临床数据
研究内容：
（1）序列分析和体细胞突变鉴定
研究手段：10对样本WGS和57对样本WES数据的体细胞突变分析；大规模临床样本生存率研究；细胞系中的功能验证。
研究结果：TP53、CDKN2A、NOTCH1和NFE2L2突变最显著。NOTCH1基因缺失突变与更高的生存率相关，且其在321个样本中的低表达与高的生存率相关。RNA干扰实验发现VANGL1突变对ESCC细胞生长影响最大，其通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号活性在ESCC中起到抑癌基因的作用。
图5 67个ESCC样本中的高频突变基因
（2）分析MYBL2的结构变异和串联重复
研究手段：通过CG Pipeline进行SV和基因组重排分析（WGS数据）
研究结果：MYBL2在ESCC中存在串联重复扩增，其表达在ESCC中也有明显上调。MYBL2表达与其DNA拷贝数显著相关。生存曲线分析显示了MYBL2拷贝数的增加与更差的预后相关。
图6 MYBL2的功能分析
（3）ESCC中的体细胞拷贝数变异(SCNA)鉴定
研究手段：基于覆盖率的算法鉴定SCNA（WGS和WES数据）
研究结果：CDKN2A在患者中存在高频有害体细胞突变。ESCC中发现的高频9p21.3缺失，在巴氏食管癌和食管腺癌中也发现过，表明9p21.3缺失可能是不同类型食管癌中重要的早期事件。
图7 在WES样本中鉴定的高频扩增和缺失
（4）存在SCNA的基因表达和生存分析
研究手段：SCNA与基因表达关联分析；基因表达与生存分析
研究结果：发现FADD、SHANK2、PCAT1和miR-4707-5p的过表达与较差的预后显著相关。
图8 FADD, SHANK2, PCAT1和miR-4707-5p与生存率的关系
（5）通路富集分析
研究手段：用DBFAT(David Bioinformatics Functional Annotation Tools)和pathview进行通路富集分析
研究结果：体细胞突变富集在肿瘤细胞增殖和迁移相关的通路中
研究意义：本研究通过对WGS和WES数据的分析，阐明了体细胞突变相关的基因组事件，研究了基因突变与预后的关系，有助于ESCC肿瘤的个性化治疗。
ESCC异质性研究
8、多区域全外显子组测序揭示ESCC中的
肿瘤内异质性[3]
发表期刊：Oncogenesis
发表时间：2015年11月
影响因子：5.02
研究方法：全外显子组测序(WES)、aCGH
研究背景：ESCC的大规模基因组测序已经鉴定了常见的突变基因如TP53等，但是ESCC的肿瘤内异质性尚未得到充分研究。
研究样本：两名ESCC患者的肿瘤-对照样本（每位患者中各取4个不同的肿瘤区域样本，1个邻近正常组织样本。）
研究内容：
（1）ESCC多个区域的突变谱
研究手段：WES数据；GATK和ANNOVAR鉴别SPM（体细胞点突变）和InDels
研究结果：两名患者之间的突变谱差异可能是ESCC发展的不同突变机制的反映
图9 两名患者ESCC不同区域的点突变和Indel的异质性
（2）ESCC多个区域中的拷贝数变化
研究手段：使用aCGH检测ESCC多个区域中的拷贝数变化，并鉴定染色体的扩增和缺失。
研究结果：PtA（病人A）表现出大量的肿瘤内染色体异质性，而在PtB（病人B）中有许多共享的染色体畸变。
图10 aCGH检测的ESCC肿瘤内基因组拷贝数改变
（3）ESCC多个区域中非沉默体细胞突变的特征
研究手段：非沉默突变基因数据；sanger测序验证；COSMIC数据库搜索；系统进化分析
研究结果：在所有肿瘤区域中特有突变的发现表明存在区域性克隆进化；PtA和PtB中的部分共有突变发生在已知的肿瘤相关基因上；通过系统发生算法对区域突变频率进行分析，重建了每个患者的肿瘤进展。
图11 PtA和PtB的系统进化树
（4）ESCC多个区域UTR(untranslated regions)
中的突变特征分析
研究手段：评估UTR区域的突变（SPM和Indels），用MiRase算法检测microRNA结合位点。
研究结果：PtA和PtB中检测到的大部分UTR区域突变无microRNA结合位点，突变的重要性未知。
（5）肿瘤内基因组功能异质性
研究手段：用KEGG和REACTOM算法进行功能预测；用药物-基因相互作用数据库（DGIDB）来预测可用药的突变。
研究结果：不同肿瘤区域的功能异质性，表明不同的调节信号传导和细胞代谢途径。来自不同肿瘤区域的数据显示出可用药突变基因进化的复杂性。
图12 ESCC中功能性基因组异质性
研究意义：单区域采样不能反映ESCC肿瘤中突变的基因组异质性，且患者之间这种基因组异质性的复杂性将使ESCC中遗传学诊断标记复杂化。因此，ESCC生物标志物和个性化治疗的发展需要对个体发育和系统发育的肿瘤异质性进行更深入的了解。
最后两篇文献，我们将与大家分享不同阶段ESCC的基因组表征的关系以及环境和遗传因素对ESCC的影响。
参考文献
1. Gao Y B, Chen Z L, Li J G, et al. Genetic landscape of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Nature Genetics, 2014, 46(10): 1097-1102.
2. Qin H D, Liao X Y, Chen Y B, et al. Genomic characterization of esophageal squamous cell carcinoma reveals critical genes underlying tumorigenesis and poor prognosis[J]. The American Journal of Human Genetics, 2016, 98(4): 709-727.
3. Cao W, Wu W, Yan M, et al. Multiple region whole-exome sequencing reveals dramatically evolving intratumor genomic heterogeneity in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncogenesis, 2015, 4(11): e175.
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撰稿：肿瘤组
编辑：市场部
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